近日，Horticultural Plant Journal在线发表了赵建军/李君团队题为“An efficient and universal protoplast-based transient gene expression system for genome editing in Brassica crops（一种高效通用并适用于基因编辑的芸薹属原生质体瞬时基因表达系统的建立）”的研究论文。 

芸薹属是十字花科中最重要的一个属，包含多种蔬菜和油料作物，对其品质进行遗传改良具有重要的意义。基因编辑作为新一代生物育种的关键技术，被广泛应用于多种作物的遗传改良。开发或者利用基因编辑编辑技术时，需要对基因编辑工具进行迭代测试或者对靶位点的活性进行验证。原生质体瞬时基因表达体系具有操作简单、转化周期短、转化效率高等优点，因此可以快速评估芸薹属作物CRISPR/Cas9基因编辑系统中靶位点的编辑效率。

在芸薹属蔬菜作物中，只有少量原生质体瞬时基因表达体系的报道，而且制备的原生质体细胞活力以及转化效率相较于其他物种均较低。本研究以大白菜和甘蓝为材料，对影响原生质体制备和转化效率的因素进行系统优化，以期在芸薹属蔬菜作物中建立一个高效通用的原生质体瞬时基因表达体系（protoplast-based transient gene expression system, PTGE）。 

通过对影响大白菜原生质体制备的因素（如取材大小、酶解时间、酶解液中甘露醇浓度）进行优化，发现以长度2 cm的真叶为材料，当使用含0.6 mol · L^-1甘露醇的酶解液酶解6 h时原生质体细胞产量为4.7×10⁵· g^-1 FW，细胞活力可达97%，表明在大白菜中建立了高效的原生质体制备体系。

图1 大白菜原生质体制备条件的优化

通过对影响原生质体瞬时转化效率的因素进行优化，发现MMG溶液中的甘露醇浓度是影响转化效率的关键因素，当甘露醇浓度为0.3 mol · L^-1时，原生质体的转化效率提升2.5倍。使用20 µg质粒，PEG中含0.2 mol · L^-1氯化钙，转化15 min（含37°C热处理6 min），转化效率可达86%。上述结果表明，在大白菜中成功建立高效的原生质体瞬时转化体系，并且该体系在不同大白菜品种中均表现出较高的转化效率。

图2 不同转染条件对大白菜原生质体转染效率的影响

进一步将该体系应用到芸薹属其他物种。在甘蓝中，使用长度1.5 cm的真叶，利用含0.6 mol · L^-1甘露醇的酶解液酶解6 h，原生质体产量和活力达到最高，分别为4.9 × 10⁵· g^-1 FW和95%。使用20 µg质粒，PEG中含0.3 mol · L^-1氯化钙，室温转化15 min，甘蓝原生质体的转化效率可达69%。另外，使用相同的原生质体制备和转化条件，不结球白菜、芥蓝和芜菁原生质体的转化效率也均超过了50%，表明该体系可以广泛应用于芸薹属多个物种。

图3 PTGE在其他芸薹属中的应用

为了验证该体系是否可以应用于CRISPR/Cas9基因编辑载体的活性验证，我们在大白菜AOP2基因、甘蓝DMR6基因和不结球白菜PDS基因上设计基因编辑靶位点。将构建完成的基因编辑载体通过PTGE分别转化对应三个芸薹属物种的原生质体，通过PCR、PCR/RE及Sanger测序证实在三个基因的靶位点均发生了基因编辑。表明该体系可以应用于多个芸薹属物种的基因编辑载体的活性验证。

图 4 CRISPR/Cas9介导的芸薹属基因突变检测

本研究通过对大白菜原生质体的制备和瞬时转化条件进行系统性的优化和探索，率先发现低渗透压处理原生质体细胞可以显著提高原生质体的转化效率，成功建立了一套高效通用的芸薹属原生质体瞬时基因表达体系（PTGE），应用本研究建立的PTGE在多个芸薹属物种中成功验证了基因编辑载体的活性，为芸薹属物种的品质改良提供了重要的技术支持。

图 5 基于原生质体的瞬时基因表达系统(PTGE)示意图

2020级硕士研究生余潇潇、本科生于金泰和青年教师卢银为该论文的第一作者，赵建军教授、李君教授和李岩副教授为该文的通信作者。李文静、霍贯中和张珺参与了本研究。该研究获得国家自然科学基金重点项目、河北省自然科学基金、河北省重点研发计划和河北农业大学启动经费的资助。

论文链接：https://doi. 10.1016/j.hpj.2024.06.001